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趙雲教授課題組聯合上海交大樊春海院士課題組構建植物基因工程新型核酸報告系統

發稿日期:2020-08-02  作者:

近日,四川大学赵云教授研究团队联合上海交通大学樊春海院士团队在Nature Communications在线发表了题为A protein-independent fluorescent RNA aptamer reporter system for plant genetic engineering的论文。该论文将纳米技术与生物技术有机结合,利用核酸纳米技术首次构建了植物RNA水平上的遗传转化报告系统,并在拟南芥和烟草的遗传转化中得到了验证。

植物基因工程是植物遺傳改良的重要工具,其中報告系統是進行靶基因操作和轉基因篩選的燈塔。現有的報告系統均是建立在蛋白質水平上,如熒光蛋白(FPs)、β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)和熒光素酶(Luc)。然而蛋白報告系統在應用中存在一些限制,如外源蛋白大量積累對植物生長發育和生理活動的負面影響,T-DNA的不完全插入導致報告基因無法真實反映靶基因的表達水平,蛋白質報告系統無法應用于非編碼RNA的研究等。RNA核酸適配體作爲RNA動態成像的重要工具,已成功應用于動物細胞中瞬時表達靶RNA的標記成像,但在植物中還沒有報道。如果能將RNA核酸適配體在植物細胞中成像,並進一步用于標記靶基因的mRNA,則可以避免蛋白報告系統在應用中的一些缺陷,在植物基因工程中將體現巨大的優勢。

图1 3WJ-nBro核酸适配体活体成像

該研究以當前RNA核酸適配體的最新進展爲基礎,設計構建了一系列新型RNA核酸適配體3WJ-nBro。3WJ-nBro與已有應用的核酸適配體F30-Broccoli相比,熒光強度和穩定性均有極顯著提高。將3WJ-nBro插入靶基因的終止密碼子之後,通過體外、原核細胞和植物細胞表達,根據3WJ-nBro標記的mRNA光學特征和穩定性,成功篩選鑒定出可用于植物細胞熒光成像的RNA適配體3WJ-4×Bro。體外實驗顯示3WJ-4×Bro標記不同長度的mRNA對其光學特征沒有顯著影響。接下來,研究人員分別在原核細胞和植物細胞中瞬時表達帶有3WJ-4×Bro標記的不同融合mRNA(AtCLE-3WJ-4×Bro,mCherry-3WJ-4×Bro和NtTubα-3WJ-4×Bro),通過共聚焦熒光成像和熒光量化分析發現3WJ-4×Bro標記可以穩定報告原核細胞和植物細胞內不同靶mRNA表達;采用DFHBI-1T凝膠染色結合RNA-Seq,證明細胞內熒光來源于完整的融合mRNA,表明3WJ-4×Bro可以准確報告mRNA的表達和位置。此外,該研究采用延時熒光成像、雙熒光共定位和免疫印迹分析等實驗證明3WJ-4×Bro在報告mRNA的同時不影響mRNA的正常生物學功能,如出核轉運和翻譯過程。

图2 3WJ-4×Bro报告不同mRNA在原核细胞中的表达

進一步,該工作研究了3WJ-4×Bro在植物轉化中的實際應用。通過比較穩定表達GFP和3WJ-4×Bro標記的NtTubα的轉基因擬南芥熒光強度,發現3WJ-4×Bro系統與GFP系統具有相同的報告能力,且3WJ-4×Bro可用于報告不同組織中靶基因mRNA的表達;分析了來自6個NtTubα-3WJ-4×Bro轉基因擬南芥T1代家系共766株T2代植株,表明3WJ-4×Bro與靶基因共分離且共表達並遵循孟德爾遺傳定律穩定遺傳至後代,3WJ-4×Bro是一個可靠的RNA水平上的植物遺傳報告系統。值得一提的是,該研究利用3WJ-4×Bro報告系統成功實現了對煙草病毒介導的RNA傳遞的可視化示蹤,爲RNA在植物細胞間的轉移示蹤研究提供了新的工具。

图3 基于3WJ-4×Bro系统的转基因鉴定和基因表达分析

該研究通過核酸納米技術首次構建RNA水平的植物基因工程報告系統,是納米科學和生命科學交叉的重要成果,突破了蛋白報告系統的應用限制,同時也爲植物RNA定位、行爲及功能研究提供可視化的新工具,對于植物基因工程的發展和應用具有重要意義。

博士研究生白九元、羅耀和王鑫爲該論文的共同第一作者,趙雲教授、樊春海院士和王睿副研究員爲通訊作者。該研究得到中央高校基礎研究經費和國家重點研發項目的資助。

原文鏈接:

https://www.nature.com/articles/s41467-020-17497-7

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